SARS病毒的背景和初步分析

    我国称为非典型肺炎的严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Sydrome，SARS）已经在22个国家和地区发生。据介绍，截至4月27日10时至28日10时，全国内地共报告新增非典型肺炎临床诊断病例203例(其中医务人员36例)，治愈出院7例，死亡9例。其中北京96例(其中59人为新发病例，37人为疑似病 例转为临床诊断病例)，死亡3例；河北3例，死亡3例(此3例死亡病例为昨日数据，今日补记)；山西29例，出院1例，死亡1例；内蒙古38例，死亡1例；河南1例；湖北1例；广东13例，治愈出院6例；甘肃1例，死亡1例。截至4月28日10时，全国内地共累计报告非典型肺炎病例3106例(其中医务人员653例，北京排除既往临床诊断病例11例)，治愈出院1306例，死亡139例。4月27日10时至28日10时，各地还报告新增非典型肺炎疑似病例290例。其中北京149例；天津12例；河北8例；山西29例；内蒙古24例；黑龙江1例；上海1例；浙江1例；安徽1例；河南3例；湖北2例；湖南1例；广东51例；重庆1例；四川4例；陕西2例。截至4月28日10时，全国内地非典型肺炎疑似病例累计为2106例。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络（见附录一）。研究发现，一种新型的冠状病毒极可能是病因，但也有可能有其他协同因素如hMPV（human metapneumovirus）使病情恶化，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸体中都分离出了这种病毒，在一些SARS病人的血清中也发现了抗hMPV的抗体。4月16日，WHO正式确认 SARS病毒是SARS的病因。96%感染SARS病毒的人能够自愈。病毒在从SARS自愈的人的血清中生长缓慢，说明人体可以针对病毒产生抗体。美国USAMRIID（U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases）正着手试验几千种经过FDA批准过的药物，以寻找能够治疗SRAS的药物。

1．初步的临床描述：

（1）潜伏期：2-7天。患者通常有高于 38 度的发热，并会伴有寒颤，或者其他如：头痛，倦怠和肌痛。典型的病例通常不会有皮疹，神经系统症状和肠胃系统的症状。少数比例报道有腹泻。

（2）下呼吸道期：3-7天以后，病程进入此期。干咳无痰，呼吸困难，甚至低氧血症（呼吸困难，紫绀，缺氧早期心动过速，血压升高，严重时出现心动过缓，血压下降，甚至休克），患者通常都需要气管插管或者呼吸机维持。

（3）血象：绝对白细胞计数减少，血小板减少。病程早期有肌酸磷酸激酶水平升高，肝转氨酶水平升高。

（4）治疗：目前没有特效治疗方法。

（5）预防：

• 勤洗手

• 保持环境卫生和空气流通

• 避免到人群聚集或空气不流通的地方

• 避免不必要的探病

• 均衡饮食

• 适量的休息和运动，增强抵抗力

SARS病毒为正链的单链RNA病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。在分类学上的地位是：

ssRNA positive-strand viruses, no DNA stage; Nidovirales; Coronaviridae; Coronavirus; SARS coronavirus

• SARS病毒相关研究文献

• SARS蛋白质以及人体中与之可能相互作用的蛋白

SARS病毒的相关序列：

• Sequence downloaded

SARS病毒的酶切图谱：

• 酶切图谱下载

• SARS病毒的表位分析初步结果

• SARS病毒的序列编码预测

• SARS病毒编码的蛋白质序列（FASTA格式）

• 冠状病毒属蛋白分类表

对SARS病毒的研究结果总结：

• SARS病人的呼吸道切片和细胞培养物的电子显微镜照片显示，冠状颗粒；

• SARS病毒可以和I群冠状病毒的多克隆抗体发生反应；

• 这是一种新型的冠状病毒，与冠状病毒属中其他已知的成员不同；

• 病毒引起VERO和FRhk-4细胞病变效应，病毒复制被SARS康复人的血清所抑制；

• 可以利用感染的细胞点和康复病人的血清进行免疫荧光检测法（Immunofluorescence assays，IFA ）检测培养细胞中细胞感染有病毒，都表现出很高水平的特异性反应。 反应从负到正，或者是在非直接的荧光反应中有诊断意义的升高。

• 美国、加拿大和香港的研究表明，非SARS病人的血清不能和新冠状病毒发生反应；

• 冠状病毒的通用引物发现SARS病人的切片和细胞培养物中发现新型冠状病毒；

• 传染性肠胃炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）、鼠肝炎病毒（Murine Hepatitis Virus ，MHV）、猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV）、229E人冠状病毒的超抗血清可以抑制培养的病毒生长；

• 几个实验室对病毒的部分测序表明，新病毒和冠状病毒属相关，但不同于同属的其他3个群；

• 动物接种直言试验正在进行。

检测SARS病毒的方法：

现有诊断手段有3种，样品处理须在3级生物安全的条件下进行，病毒培养和动物试验需要在3+级的条件下进行：

• 1.抗体检测：ELISA（IGM/IGA）方法可以可靠地检出出现临床症状20天后SARS病人血清中的病毒抗体。某些病人在14-21天时，已经可以检测到抗体。免疫荧光法检测可以检测出病毒感染VERO细胞10天后产生的 M免疫球蛋白；

• 2.分子检测方法：已经发展了7对引物（见附录二）使用于检测过程中，检测中的阳性对照RNA可以从Bernhard-Nocht Institute in Hamburg, Germany免费获得。检测样品包括血液、粪便、呼吸道分泌物。PCR结果可以辅助临床诊断评价，但是不能肯定或排除疾病的可能；

• 3.细胞培养方法：利用VERO细胞来检测SARS病人的呼吸道分泌物和血液样品，阳性结果表示SARS病人感染了冠状病毒，阴性结果不表明病人不是SARS。

4月19日，军事医学科学院微生物及传染病研究所所长杜新安表示，除间接免疫荧光技术外，他们又发现三种快速检验SARS(非典型肺炎)的方法。目前他们正在夜以继日加紧研制开发有关诊断试剂。专家表示，新试剂会进一步缩短免疫荧光技术创造的两小时的检测时间。据悉，新方法包括使用PCR技术，PCR是一种体外基因复制技术，可在几十分钟内把基因扩增到数百万倍以上，使基因便於检测。据悉，新的检验方法将不局限于对血样的监测，痰液、唾液和漱口液也可成为快速检测的依据。自从快速检验SARS的消息公布以来，已有多家军、地医院送来血样，要求军事医学科学院协助检测。

基因组测序及分析：

目前美国（CDC，USA）和加拿大（BCCA Genome Sciences Centre, British Columbia Centre for Disease Control and National Microbiology Laboratory Canada）的实验室完成SARS病毒的基因组测序。比较二者已经公开的病毒全基因组序列，发现有很小的差异。美国Urbani株长度为29，727 nt，其5ˊ端多出一段TTATTAGGTTTTTAC（15nt）；加拿大病毒株长度为29，736nt，其3ˊ端多出24个A。相对于Urbani株，加拿大病毒株其他位置的差别依次为：

7919（T→C），16622（T→G），19064（G→A），19183（C→T），20596（A→G），20910（G→T），23220（T→G），24872（C→T），26857（C→T）。

除了这些差别，SARS病毒基因组与其他冠状病毒的结构相似。初步的基因组注释在NCBI完成，预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白（聚合酶1a, 1b），S蛋白（spike protein），E蛋白（small membrane protein），N蛋白（nucleocapsid protein）等。使用Clustalx 1.82，用 neighbor-joining tree方法构建的冠状病毒的进化关系树如下：

M蛋白：

N蛋白：

S蛋白：

可以看出，SARS病毒明显不同于同其他三个冠状病毒群，可能归属于新的冠状病毒群。和其他人类及动物冠状病毒相比，核酸序列相似性分数是0.56-0.63，氨基酸序列的相似性分数是0.57-0.74。

    在NCBI，SARS病毒为查询序列对nr库按默认条件进行blastx搜索， 发现下列几种病毒和SARS病毒的序列相似性较高：

• NC_002645，human coronavirus 229E，27,317bp，AF304460

• NC_001846，Murine hepatitis virus，31,357bp

• NC_001451，Avian infectious bronchitis virus，27,608bp

• NC_003045，Bovine coronavirus，31,028bp

• NC_003436，Porcine epidemic diarrhea virus，28,033bp

• NC_002306，Transmissible gastroenteritis virus,complete genome，28,586 bp

    总体上看，几种病毒的基因组结构非常相似。通过病毒基因组之间的比较，14k-16k的位置，对所有病毒，都是较为保守的区域。这区域编码RNA-dependent RNA polymerase，推测病毒的复制直接使用该酶。下图以人冠状病毒说明病毒的基因组结构。

抗原性分析：

对预测得到的基因进行抗原性分析，下表是分析结果。

A：结果好；B：结果一般；C：结果差；-：无结果；not：没有预测

附录一  国际协作网络成员及地址

• Centers for Disease Control & Prevention
  National Centers for Infectious Diseases
  1600 Clifton Road, Mailstop G16
  Bldg 7, Room 111
  Atlanta, Georgia 30333
  United States

• The Chinese University of Hong Kong
  Prince of Wales Hospital
  Shatin, NT Hong Kong SAR
  China

• Erasmus Universiteit, National Influenza Centre
  Dr Molewaterplein 50, P. O. Box 1738
  3000 DR Rotterdam
  The Netherlands

• Government Virus Unit
  9/F Public Health Laboratory Centre
  382 Nam Cheong Street
  Shek Kip Mei
  Kowloon, Hong Kong SAR
  China

• Guangdong Center for Disease Control & Prevention
  176 West Xingang Road
  Guangzhou 510300
  China

• Institut für Medizinische Virologie im Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main
  Paul-Erlich Strasse 40, D - 60596
  Frankfurt
  Germany
  (in collaboration with Institute for Tropical Medicine, Hamburg and Phillips University, Marburg)

• Institut Pasteur
  Head of Unit, Unité de Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires
  National Influenza Center (Northern-France),
  25 rue du Docteur Roux
  Cedex 15 F-75724 Paris
  France

• National Institute of Infectious Diseases
  Department of Viral Diseases and Vaccine Control
  Gakuen 4-7-1
  Musashi-Murayama-shi
  Tokyo
  JP-208 0011
  Japan

• National Microbiology Laboratory
  Population Pubic Health Branch
  Health Canada
  1015 Arlington Street
  Winnipeg, Manitoba R3E 3R2
  Canada

• Public Health Laboratory Service
  Central Public Health Laboratory
  61 Colindale Avenue
  London NW9 5HT
  United Kingdom

• University of Hong Kong Faculty of Medicine
  University Pathology Building
  Queen Mary Hospital
  Hong Kong SAR
  China

• Virological Institute
  Chinese Center for Disease Control & Prevention
  Yinxin Road 100
  Beijing 100052
  China

• Virology Unit
  Singapore General Hospital
  Outram Road
  169 608
  Singapore

附录二  发展检测SARS病毒引物的研究机构及7对引物序列

Bernhard-Nocht Institute
Bernhard-Nocht Str. 74
D-20359 Hamburg
Germany

BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC
antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C
FraGment lenGth 195 bp

BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG
antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G
Fragment length 110 bp

SAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA
antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG
Fragment length 150 bp

Amplicon sequence (BNI-1, Bernhard-Nocht Institute, Hamburg, Germany)
TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCA
AGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTAT
TCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCAT
GCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGA
TTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGA
CACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCC
ACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC （扩增产物在基因组上的位置：18,105......18,406）

Centers for Disease Control & Prevention
National Centers for Infectious Diseases,
Atlanta GA 30333
1600 Clifton Road, NE, MS-C12
United States
IN-2,IN-4: sense 5' GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3'
antisense 5' TAACACACAAACACCATCATCA 3'
Expected product size: 452 bp

IN-6,IN-7: sense 5' GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA 3'
antisense 5' CCATCATCAGATAGAATCATCATA 3'
Expected product size 440 bp

Government Virus Unit
9/F Public Health Laboratory Centre
382 NAm Cheong Street
Shek Kip Mei
Kowloon, Hong Kong SAR
Hong Kong - SAR China

COR-1,COR-2: sense 5' CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3'
antisense 5' AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3'
Expected product size: 310 bp

Queen Mary Hospital
The University of Hong Kong
University Pathology Building
Hong Kong - SAR China
HKU: sense 5' TACACACCTCAGCGTTG 3'
antisense 5' CACGAACGTGACGAAT 3'
Product size 182 bps